Caracterização genética, filogenética e detecção de microrganismos diazotróficos associados a plantas não-leguminosas no sistema solo-planta

Código: 03.2000.126

Líder do projeto: Kátia Regina dos Santos Teixeira

Resumo:

Nos últimos quatro anos, durante a realização do projeto 03.096.124, foram obtidos avanços significativos sobre a caracterização genética da fixação biológica de nitrogênio (FBN) e filogenética de isolados cuja identidade ou parentesco não puderam ser claramente definidos apenas através de métodos tradicionais. Como resultado um grande número de isolados estão mantidos nos laboratórios e precisam ser caracterizados geneticamente para que representantes de grupos com potencial genético semelhante sejam preservados em bancos ou coleção de culturas. O estabelecimento de técnicas moleculares na rotina do laboratório de Genética e Bioquímica foi bastante importante para o avanço dos estudos de caracterização genética de bactérias diazotróficas já descritas, como Azospirillum amazonense, Burkholderia spp., Herbaspirillum spp. e Acetobacter diazotrophicu,e de novos isolados derivados de diversos estudos de ecologia relacionados a FBN em associação com plantas não-leguminosas. O desenvolvimento de sondas oligonucleoítidicas e primers específicos para gêneros e espécies de bactérias diazotróficas já conhecidas foi essencial para a apliação de técnicas moleculares nos estudos de caracterização associados a área de fixação biológica de nitrogênio em não-leguminosas. Além disso, a aplicação de técnicas capazes de gerar padrões genéticos ("fingerprinting"), tais como ARDRA, RAPD e Rep-PCR entre outras, têm permitido avaliar a diversidade entre e dentro de grupos de diversos organismos facilitando dessa forma os agrupamentos de indivíduos relacionados. Além disso, a introdução de técnicas moleculares apropriadas para o estudo da diversidade microbiana tem sido considerada uma ferramenta valiosa nos estudos de amostras ambientais capaz de, devido a sua alta sensibilidade, superar a limitação da não culturabilidade de uma grande parte da biota associada aos diversos ecossistemas. Um outro aspecto importante na caracterização dos isolados é a descrição dos genes envolvidos no processo de FBN. Apesar da existência de uma grande quantidade de informações associadas ao papel e expressão dos gene nif, o mecanismo que regula a ativação do sistema de transcrição desse conjunto de genes ainda é considerado um dogma devido a influência direta do habitat e fatores associados, como disponibilidade de N e concentração de oxigênio, neste complexo circuito de sinais e ativação de genes específicos para o processo. Neste projeto será dado ênfase à aplicação de técnicas moleculares nos estudos de bactérias diazotróficas isoladas ou associadas a culturas de arroz, cana-de-açúcar e de pastagens de diferentes genótipos de Brachiaria visando o avanço de conhecimento e validação do seu potencial para aplicação em amostras ambientais. Além disso, estudos de caracterização dos genes nif em bactérias diazotróficas endofíticas serão realizados como forma de estabelecer um modelo do processo de FBN dessas bactérias em interação com a planta.

 

Subprojetos:

Ø 03.2000.126-01 - Aplicação de técnicas moleculares no estudo da comunidade de bactérias diazotróficas associada ao solo cultivado e plantas de cana-de-açúcar, arroz e Brachiaria

Resumo:

Bactérias fixadoras de nitrogênio são comumente encontradas em associação a diversos sistemas solo/planta sugerindo, que no decorrer do tempo, importantes contribuições da fixação biológica de nitrogênio (FBN) para as reservas de N desses sistemas possam ser esperadas. Durante as últimas décadas, foram realizados a maioria dos estudos de isolamento e identificação de bactérias fixadoras de N2 associadas às gramíneas como por exemplo cereais, cana-de-açúcar e forrageiras. Neste período, algumas bactérias diazotróficas associadas às raízes e interior dos tecidos vegetais foram isolados. Dentre elas destacam-se as espécies do gênero Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter diazotrophicus e mais recentemente Burkholderia spp. Técnicas moleculares, baseadas na sequência do rRNA da subunidade 23S do ribossoma, aplicadas nos estudos de caracterização filogenética e ecologia de bactérias diazotróficas associadas as gramíneas têm permitido identificação ao nível de gênero e espécie além de ser capaz de detectar esses organismos na faixa de 104-105 células/ml em amostras derivadas de culturas de células ou extratos vegetais. Não obstante, uma melhor avaliação da biodiversidade de bactérias diazotróficas presentes no solo cultivado e associadas às raízes ou planta como um todo deve ter sido prejudicada devido a não-culturabilidade de certos organismos durante o processo de isolamento e às limitação de técnicas e equipamentos disponíveis na época. A ênfase crescente no uso ecologicamente correto do meio ambiente e de uma agricultura economicamente viável tem sido responsável pela grande demanda de manejo da comunidade microbiana do solo visando o implemento da produção agrícola. Microrganismos do solo e endofíticos desempenham um papel muito importante na nutrição vegetal, entretanto é necessário uma maior compreensão dos fatores que influenciam a atividade e diversidade microbiana de certas populações em certos habitats. Este subprojeto propõe o estudo da biodiversidade de bactérias, principalmente relacionadas com gêneros e espécies de fixadores de nitrogênio já conhecidos, associadas ao solo rizosférico e às plantas de áreas cultivadas com gramíneas, através do uso de técnicas moleculares (PCR, hibridização com sondas oligonucleotídicas e geração de padrão genético através de TGGE) visando estabelecer parâmetros para incrementar a produtividade através da contribuição da fixação biológica de nitrogênio e garantindo a manutenção da sustentabilidade ou longevidade associada às culturas.

 

Ø 03.2000.126-02 - Isolamento e caracterização de genes nif de bactérias endofíticas associadas às gramíneas

Resumo:

Algumas bactérias diazotróficas tem sido amplamente utilizadas como organismos modelos para investigações em laboratórios, inclusive aos relacionados com a genética da Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN). Muitas vezes os modelos estudados apresentam peculiaridades que não permitem estabelecer um padrão universal entre organismos devido a influência de fatores externos nos mecanismos de expressão e regulação gênica, como por exemplo o nicho ecológico e o tipo de interação estabelecido entre organismos. As espécies mais utilizadas para o isolamento e caracterização genética e bioquímica da nitrogenase, e que resultou na grande parte da informação sobre a genética da FBN, foram representantes de bactérias diazotróficas de vida-livre, tais como Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Azotobacter vinelandii e A. chroococcum. A descoberta, a partir de 1988, de bactérias diazotróficas endofíticas que colonizam em números elevados raízes, colmos e folhas de cana-de-açúcar, arroz e também outras gramíneas, mudou completamente o conceito de associações rizosféricas e melhor explica as elevadas contribuições destas bactérias para o suprimento de nitrogênio às culturas, como observado em algumas variedades de cana, onde até 60% do N-acumulado pode corresponder a fixação de nitrogênio pelas bactérias diazotróficas endofíticas. A necessidade de gerar conhecimento básico sobre a genética da FBN de novos isolados considerados como diazotrófos endofíticos levou nosso grupo a iniciar estudos de caracterização genética de Acetobacter diazotrophicus. A construção do banco genômico de A. diazotrophicus já permitiu o isolamento de diversos genes nif através da hibridização com sondas heterólogas e complementação de mutantes específicos. Os resultados obtidos através do sequenciamento desses genes revelou uma homologia significativa com genes nif de bactérias do grupo de rizóbios, o que pode ser interpretado como evidência de uma interação mais eficiente ou especializada entre a bactéria e a planta. Recentemente foi construído, em nosso laboratório, um banco genômico a partir do DNA total de uma nova espécie de diazotrófo do gênero Burkholderia, cujo nome proposto é B. brasilensis. O subprojeto propõe dar continuidade a estes estudos através do isolamento de genes nif à partir do banco genômico de B. brasilensis além de caracterizar os mecanismos envolvidos na regulação e expressão desses genes em B. brasilensis e A. diazotrophicus. Através dos resultados obtidos poderemos adquirir informações essenciais para geração de mutantes e que permitam estabelecer estratégias para implementar o uso de todo o potencial biotecnológico desses microrganismos diazotróficos endofíticos.

 

Ø 03.2000.126-03 - Caracterização filogenética de bactérias diazotróficas endofíticas isoladas de gramíneas e outras plantas não leguminosas

Resumo:

A fixação biológica de nitrogênio avançou bastante nos últimos anos. Neste período foram isolados diversos gêneros e espécies de bactérias fixadoras de nitrogenio de diversas gramíneas e outras plantas não leguminosas de interesse agronômico. A maioria destes microrganismos estão agrupados com base em características morfológicas e fisiológicas e que nem sempre permitem uma agrupamento taxonômico correto. Desse modo, os laboratórios acabam acumulando um grande número de isolados sem que haja realmente a necessidade de manutenção de todos. Por outro lado, a biologia molecular promoveu um avanço considerável na área de microrganismos diazotróficos nos últimos anos. Já encontram-se disponíveis sondas oligonucleotídicas espécies e gênero específicos baseados na subunidade DNAr 23S para a maioria das espécies descritas. As mesmas podem ser usadas em estudos rápidos de caracterização destas bactérias como por exemplo através da técnica de amplificação gênica ou mesmo de hibridização. Além disso, a biolgia molecular tem permitido que a diversidade genética de bactérias fixadoras de nitrogênio seja melhor estudada. O conhecimento da diversidade genética dos isolados diazotróficos pertencentes as espécies e gêneros identificadas através de sondas permitirá definir quais estirpes serão encaminhadas a coleção de cultura para preservação. Além disso, permitirá que as estirpes com potencial de uso nos inoculantes comerciais sejam reconhecidas após a liberação no ambiente. O presente subprojeto tem por objetivo efetuar a caracterização filogenética dos isolados de bactérias fixadoras de nitrogênio mantidas pelos pesquisadores da Embrapa Agrobiologia através do uso de sondas e primers espécie-especificos. Pretende também efetuar o estudo da diversidade genética destas bactérias e daquelas pertencentes a Embrapa Trigo de modo a contribuir para os estudos de monitoramento das estirpes passíveis de uso em inoculantes comerciais. Espera-se ao final do projeto que a caracterização de cerca de 400 isolados tenham sido avaliados via o uso de sondas espécies específicas e também agrupados através da diversidade genética e que representantes dos distintos grupos sejam incorporados a coleção de cultura da Embrapa Agrobiologia.