Desenvolvimento de bactérias diazotróficas endofíticas geneticamente modificadas com atividade larvicida contra os insetos Migdolus spp e Diatraea sac

Código: 03.2001.128

Líder do projeto: José Ivo Baldani

Resumo:

A ocorrência de pragas, principalmente insetos da ordem lepidóptera e coleóptera, têm contribuído para diminuir a produção de cana-de-açúcar. O controle destes insetos tem sido feito através de produtos químicos e principalmente de métodos biológicos que utilizam parasitas, predadores ou microrganismos entomopatogênicos. Dentre estes últimos, Bacillus thuringiensis é o mais amplamente utilizado, através da ação da delta-endotoxina, uma proteína produzida por genes cry presente nesta bactéria e que tem-se mostrado tóxica para diversos insetos. A introdução dos genes cry, em bactérias diazotróficas que colonizam endofíticamente a cana-de-açúcar, como por exemplo o Gluconacetobacter diazotrophicus e Herbaspirillum seropedicae, tornaria possível o controle de insetos pragas que se alimentam dos tecidos desta cultura já que as bactérias endofíticas, geneticamente modificadas, deverão produzir e liberar a toxina no interior dos tecidos vegetais. Neste sentido propõe-se usar esta estratégia para o controle da praga Diatraea saccharalis e Migdolus spp que atacam a lavoura canavieira. No caso de Migdolus spp, os estudos se encontram em fase mais avançada conforme relatado no relatório do projeto anterior. Já foi demonstrado a expressão do gene nestas bactérias, porém a quantidade produzida é baixa, embora os bioensaios em laboratório mostraram a morte de 50% das larvas. Assim, o subprojeto 01 propõe dar continuidade aos estudos com o Migdolus, através da fusão e expressão do gene cry3A sob o controle do promotor do gene nifB de Gluconacetobacter diazotrophicus usada como vetor e bioensaios em regime de contenção com larvas do inseto. No caso da praga D. saccharalis (subprojeto 02), já foi selecionado um isolado de Bacillus thuringiensis com alta atividade entomopatogênica e também identificado os possíveis genes cry responsáveis pela morte das larvas. As etapas previstas consistem na clonagem e expressão destes genes nas bactérias diazotróficas endofíticas acima e posterior realização de bioensaios em regime de contenção para avaliar a eficiência do bactéria contendo o gene de interesse no controle da praga.

 

Subprojetos:
Ø 03.2001.128-01 - Expressão do gene cry3A em bactérias diazotróficas endofíticas e seu papel no controle de pragas de Migdolus spp que ataca a lavoura canavieira.

Resumo:

Bacillus thuringiensis é uma bactéria caracterizada pela sua capacidade de sintetizar proteínas com atividade inseticida durante a fase de esporulação. A produção destas proteínas, também denominadas delta-endotoxinas, é controlada pelos genes cry sob a ação de promotores específicos, inclusive sujeitos a regulação dependente do estágio celular, como por exemplo o estágio de esporulação. A inserção dos genes cry em bactérias diazotróficas endofiticas de cana-de-açúcar, como no caso de Gluconacetobacter diazotrophicus já foi realizada com sucesso, porém o promotor utilizado para mediar a expressão desse gene é originário do gene nifH de Rhizobium, o qual pode não estar expressando todo o seu potencial. Neste sentido propõe-se analisar a expressão do gene cry sob o controle do promotor do gene nifB de G. diazotrophicus visando aumentar os níveis de produção da toxina por esta bactéria. Para alcançar este objetivo será usada a estratégia de clonagem do produto da fusão, através da técnica de PCR, do promotor do gene nifB próximo a região codificadora do gene cry3A seguido pela inserção desta construção em um plasmídio suicida, capaz de transferir o cassete contendo o promotor ligado ao gene para o DNA cromossomal de G. diazotrophicus pelo método de conjugação triparental. Em seguida será avaliado no recombinante de G. diazotrophicus, derivado da inserção cromossomal da fusão pnifB-cry3A, o grau de expressão do gene cry comparando-o com o obtido através da construção contendo o mesmo gene sob o controle do promotor do gene nif de Rhizobium.

 

Ø 03.2000.128-02 - Clonagem e expressão de genes cry, com atividade entomopatogênica a praga Diatraea saccharalis, em bactérias diazotróficas endofíticas.

Resumo:

Já foram realizados bioensaios em cooperação com a COPERSUCAR para selecionar, dentre os isolados de B.thuringiensis fornecidos pela Embrapa Cenargen, um isolado com potencial entomopatogênico ao inseto Diatraea saccharalis. Este isolado já identificado (S76) será então usado na preparação do banco genômico visando o isolamento e clonagem do(s) gene (s) cry em vetor de expressão em colaboração com a Dra. Marlene T. de Souza da UnB. O(s) gene(s) clonado e sequenciado será então usado para os estudos de transferência e expressão em estirpes diazotróficas que colonizam endofiticamente a cana-de-açúcar (G. diazotrophicus e H. seropedicae). As bactérias transgênicas serão então inoculadas em plantas micropropagadas de cana-de-açúcar e avaliadas quanto a capacidade das mesmas de colonizarem as plantas e expressarem o gene cry de interesse. Nos casos onde houver a expressão dos genes nas plantas, os tecidos vegetais serão então usados em bioensaios em laboratório para avaliar a eficiência no controle da D. saccharalis. Em seguida serão então realizados experimentos em casa -de- vegetação, em regime de contenção com plantas de cana-de-açúcar inoculadas com as bactérias transgênicas e infestadas com o inseto D. saccharalis. Os experimentos em pequena escala a nível de campo dependerão da autorização da CNTBIO.